CRISPR/ Cas9 （Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是最近几年兴起用于靶向基因特定DNA修饰的重要工具。CRISPR是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。细菌在CRISPR和Cas9的帮助下，可以经由小RNA分子的引导，靶标和沉默入侵者遗传信息的关键部分。在该系统中，crRNA（CRISPR-derived RNA）与tracrRNA（trans-activating RNA）结合形成的复合物能特异性识别靶基因序列，并引导Cas9核酸内切酶在靶定位点剪切双链DNA，随后，细胞的非同源末端连接修复机制（NHEJ）重新连接断裂处的基因组DNA，并引入插入或缺失突变。我们也可以提供一个外源双链供体DNA片段（Donor）通过同源重组（HR）整合进断裂处的基因组。从而达到对基因组DNA进行修饰的目的。目前，CRISPR/Cas9系统的高效基因组编辑功能已被应用于多种模式生物，包括人、小鼠、大鼠、斑马鱼、秀丽隐杆线虫、植物及细菌。

　　客户只需提供物种、基因名称和靶细胞，言行生物提供整套的CRISPR/Cas9基因编辑的稳定细胞系构建服务和结果报告。

服务流程

一、预实验

1. Cas9导入细胞方法：尝试各种方法，如脂质体类转染、电转、慢病毒感染、腺病毒感染等，确定高效导入Cas9方法。

2. 药物浓度预实验：降低后续阳性克隆筛选和检测工作难度。

3. 单克隆培养情况：观察细胞是否可以单克隆培养。

二、基因敲除（敲入）

1. 靶点设计

一般在不同转录产物的共同外显子上设计3个靶点，靶点位置尽量在基因CDS的前1/3，ATG之后，最好能破坏重要的domain和所有的转录产物isoform。第一批合成构建3个，效果不佳或时间紧张的可一次构建6个。

2. 载体构建和病毒包装

根据预实验结果，选择合适的普通载体或病毒载体，言行生物现拥有3类载体：普通Cas9载体、慢病毒Cas9载体和腺病毒Cas9载体。

3. 内源活性筛选

转染细胞或感染细胞48H后，使用Puro或Blasticidin筛选48H，提取基因组DNA。使用T7E1酶验证打靶载体的活性。将有效的突变型PCR产物测序验证。

4. Donor载体(基因敲入)

根据筛选的gRNA靶点位置，构建Donor普通载体或腺病毒载体。共转染/感染 Cas9-gRNA和Donor。

5. 单克隆筛选

无限稀释到每孔1个细胞的数量，每株细胞铺至少2个96孔板。细胞长好够，验证内源活性并送测。

6. 获得突变型

如需纯合子，则可能需要重复步骤3-5。

成功实例

293T细胞基因点突变：

参考文献

1、RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9 .Science. 2013 Feb 15 339(6121):823-6.

2、Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 2013 Feb 15 339(6121):819-23.