简介
目前已经发现的环状RNA（circRNA）已多达十万种，当今通过筛选获取环状RNA（circRNA）主要有两种途径，一是高通量测序，二是芯片检测。高通量测序不仅通量大、信息准确，而且可以发现新的环状RNA，是目前筛选环状RNA最有效的方法。
测序流程
检测原理
通过高通量测序技术检测circRNA最关键的原理是寻找反向剪接的reads，即back-splicing reads。
数据分析内容
1、测序序列质量评估
2、基因组比对
3、CircRNA预测
4、CircRNA注释
5、CircRNA表达定量
6、CircRNA差异表达分析
7、CircRNA关联基因的GO/KEGG富集分析
8、CircRNA-miRNA靶向预测
9、CircRNA-miRNA网络构建
结果展示
1. circRNA预测及数目统计
应用Memczak等的方法进行circRNA的预测。每个样本mapping到基因组各个染色体的reads以及back-splicing reads可以通过圈图展示，如下：
基因组比对分布图
说明：以1K的窗口得出基因组的一个覆盖分布，图中最外圈为基因组，里面每一个圈表示一个样本的染色体reads覆盖，其中红色代表该样本中back-splicing reads的覆盖情况。
对所有预测获得的circRNA与circBase数据库的已知circRNA的位置信息进行比较，可以区分出新预测出来的novel circRNA和已知的known circRNA，统计如下：
samples | total circRNA | known circRNA(overlap with circBASE) | overlap ratio | novel circRNA |
case | 35,135 | 11,513 | 32.77% | 23,622 |
control | 39,569 | 11,995 | 30.31% | 27,574 |
2. circRNA表达定量及差异分析
目前，对于绝大多数的circRNA而言都无法获得其完整的序列，因此只能用circRNA的back-splicing位点处的junction reads来计算其表达量，这里我们采用SRPBM对reads进行归一化处理。用edgeR软件计算筛选差异表达的circRNA，得出p-value后进行多重假设检验校正，通过控制FDR（False Discovery Rate）来决定p-value的阈值，校正后的p-value即q-value。差异circRNA的散点图和火山图如下：
3. circRNA关联基因的GO和KEGG富集分析
根据circRNA的位置信息，可以获得与circRNA所在基因组位置上相关联的蛋白编码基因，然后我们对差异circRNA所对应的基因进行GO和KEGG富集分析图如下：
4. circRNA-miRNA靶向预测及网络构建
用miRanda软件预测差异表达circRNA与miRNA的靶向结合关系，并绘制网络图。如下：
案例分析
1、鼠脑及神经组织进行 circRNA 测序，发现17个差异表达的circRNA的表达和其对应mRNA的表达是相对独立的。如下图：
2、研究发现 circular RNA 的生成依赖于5' 剪切位点的7 bp 和3' 剪切位点的11 bp 核心保守序列。如下图：
样品要求
1、总RNA：浓度≥200 ng/μl，总量≥20 μg；
2、组织样品：动物、植物、微生物总量大于400 mg的新鲜样品。
3、血液4ml以上，血清2ml以上。
4、保存在超低温冰箱中，利用干冰运输。
参考文献
1、Memczak S, Jens M,Elefsinioti A, Torti F, Krueger J, Rybak A, Maier L, Mackowiak SD, GregersenLH, Munschauer M, Loewer A, Ziebold U, Landthaler M, Kocks C, le Noble F,Rajewsky N. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatorypotency.Nature. 2013 Mar 21;495(7441):333-8.
2、Hansen TB, Jensen TI,Clausen BH, Bramsen JB, Finsen B, Damgaard CK, Kjems J.
Natural RNA circles function as efficientmicroRNA sponges.Nature. 2013 Mar 21;495(7441):384-8.
3、Xiao-Ou Zhang, Hai-Bin Wang, Yang Zhang, Xuhua Lu, Ling-Ling Chen, Li Yang. Complementary Sequence-Mediated Exon Circularization. Cell, September 18, 2014; DOI:10.1016/j.cell.2014.09.001
4、Zhang Y, Zhang X O, Chen T, et al. Circular intronic long noncoding RNAs[J]. Molecular cell, 2013, 51(6): 792-806. 5、YRybak-Wolf A, Stottmeister C, Glažar P, et al. Circular RNAs in the Mammalian Brain Are Highly Abundant, Conserved, and Dynamically Expressed [J]. Molecular Cell, 2015, 58:870–885.
6、Zhang Y, Yang L, Chen L, et al. Circular Intronic Long Noncoding RNAs [J]. Molecular Cell. 2013, 51(6):792–806.
